Trois espèces marines du genre Fulvivirga, riches sources de glucides

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 6301 (2023) Citer cet article

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Bacteroidota est un groupe de dégradeurs de polysaccharides marins, qui jouent un rôle crucial dans le cycle du carbone dans les écosystèmes marins. Dans cette étude, trois nouvelles souches de glissement, désignées SS9-22T, W9P-11T et SW1-E11T, isolées d'algues et de bois en décomposition ont été proposées pour représenter trois nouvelles espèces du genre Fulvivirga. Nous avons identifié un grand nombre de gènes codant pour des enzymes glucidiques actives, qui participent potentiellement à la dégradation des polysaccharides, sur la base du séquençage du génome entier. Les similitudes de séquence d'ARNr 16S entre eux étaient de 94,4 à 97,2% et contre les espèces existantes du genre Fulvivirga de 93,1 à 99,8%. Les génomes complets des souches SS9-22T, W9P-11T et SW1-E11T comprenaient un chromosome circulaire d'une taille de 6,98, 6,52 et 6,39 Mb, respectivement ; les teneurs en GC étaient de 41,9 %, 39,0 % et 38,1 %, respectivement. L'identité moyenne des nucléotides et les valeurs d'hybridation numérique ADN-ADN avec les membres du genre Fulvivirga, y compris les isolats, se situaient respectivement dans une plage de 68,9 à 85,4% et de 17,1 à 29,7%, ce qui est faible pour la proposition de nouvelles espèces. L'exploration génomique dans trois génomes a identifié des centaines d'enzymes glucidiques actives (CAZymes) couvrant jusqu'à 93 familles CAZyme et 58 à 70 groupes de gènes CAZyme, dépassant le nombre de gènes présents dans les autres espèces du genre Fulvivirga. Les polysaccharides d'alginate, de chitine, de laminarine, d'amidon et de xylane ont été dégradés in vitro, soulignant que les trois souches sont de riches sources de CAZymes de dégradeurs de polysaccharides pour des applications biotechnologiques. Les caractéristiques phénotypiques, biochimiques, chimiotaxonomiques et génomiques ont soutenu la proposition de trois nouvelles espèces dans le genre Fulvivirga, pour lesquelles les noms Fulvivirga ulvae sp. nov. (SS9-22T = KCTC 82072T = GDMCC 1.2804T), Fulvivirga ligni sp. nov. (W9P-11T = KCTC 72992T = GDMCC 1.2803T), et Fulvivirga maritima sp. nov. (SW1-E11T = KCTC 72832T = GDMCC 1.2802T) sont proposés.

La dégradation des polysaccharides marins par les bactéries hétérotrophes joue un rôle important dans le cycle du carbone1,2. Les polysaccharides sont des molécules de glucides polymères à longue chaîne construites par des liaisons glycosidiques qui relient des unités monosaccharidiques3. Dans le milieu marin, les algues marines sont l'un des principaux producteurs de polysaccharides à l'échelle mondiale. Les algues rouges, telles que Eucheuma sp.4 et Polyneura sp.5,6, contiennent de l'agar, du carraghénane, du mannane et du xylane. Les algues vertes, telles que Chlamydomonas sp.7, Chlorella sp. et Ulva sp.8,9, contiennent de la cellulose, des galactanes sulfatés, de l'ulvane et du xylane. Les algues brunes, telles que Ascophyllum sp., Fucus sp.10 et Laminaria sp.11, contiennent de l'alginate, du fucoïdane et de la laminarine. Les algues diatomées, telles que Tetraselmis sp.12, contiennent de l'arabinogalactane, des polysaccharides sulfatés contenant du fucose, du mannane et du galacturonan13. Dans les polysaccharides marins, le squelette glycane contient généralement des substitutions du groupe méthyle14, du pyruvate15 et du sulfate16 pour que les organismes marins s'adaptent aux conditions marines17,18. Les bactéries hétérotrophes marines possèdent diverses enzymes pour digérer ces polysaccharides en cassant les liaisons glycosidiques, et pour convertir les composés de poids moléculaire élevé en composés de poids moléculaire inférieur19. Cette production et biodégradation des polysaccharides est considérée comme une étape critique du cycle du carbone dans les écosystèmes marins13,20,21. D'autre part, les oligosaccharides d'algues ont de nombreuses applications potentielles dans les aliments fonctionnels, la biomédecine et les cosmétiques22, ainsi que dans les industries des biocarburants et de la pâte à papier23,24. Par exemple, il a été démontré que la laminarine et les oligosaccharides de laminarine avaient diverses activités biologiques, notamment des effets antioxydants, antitumoraux et prébiotiques, et qu'ils contribuaient au mécanisme immunomodulateur25. De plus, l'alginate et ses oligosaccharides dérivés ont également des activités similaires telles que des activités antimicrobiennes, antihypertensives, anticoagulantes et antidiabétiques26,27. La demande de bio-production d'oligosaccharides d'algues augmente en conséquence. Il est donc important d'identifier de nouveaux microorganismes dégradant les polysaccharides.

Le phylum Bacteroidota (synonyme hétérotypique de Bacteroidetes) contient des gènes uniques pour la dégradation des polysaccharides28. Cette machinerie unique comprend SusD, qui capture les polysaccharides. Des enzymes extracellulaires glucidiques actives (CAZymes) sont ensuite sécrétées pour dégrader les polysaccharides en oligosaccharides, qui sont importés dans le périplasme via des transporteurs SusC sur la membrane29,30. Dans le périplasme, les enzymes dégradant les sucres dégradent davantage les oligosaccharides en monosaccharides31. Par la suite, des transporteurs dédiés délivrent ces monosaccharides pour traverser le cytoplasme29,31,32. Les régulateurs de l'expression des gènes fonctionnent en détectant les petites molécules dégradées qui sont des produits de la dégradation des polysaccharides33. Ces CAZymes, transporteurs et régulateurs sont étroitement codés par la région d'un chromosome connue sous le nom de loci d'utilisation des polysaccharides (PUL)34. Dans le milieu marin, les représentants de la classe Flavobacteriia du phylum Bacteroidota, bien connus comme dégradeurs de polysaccharides marins35,36,37,38, contiennent des PUL avec un nombre élevé de sulfatases36. Les sulfatases sont nécessaires pour éliminer les esters sulfatés ou sulfamates de ces polysaccharides sulfatés39, qui subissent une sulfatation sous une forte concentration de sulfate dans le milieu marin. Cependant, peu d'études ont rapporté la capacité de dégradation des polysaccharides de la classe Cytophagia, en particulier la famille Fulvivirgaceae.

Des membres du genre Fulvivirga, qui appartiennent au phylum Bacteroidota, ont été découverts dans diverses zones de l'environnement marin40,41,42,43,44,45, mais leur capacité à dégrader les polysaccharides n'est pas bien comprise. Le genre Fulvivirga décrit pour la première fois par Nedashkovskaya et al. (2007) appartient à la famille Fulvivirgaceae, ordre Cytophagales et classe Cytophagia. Les membres du genre Fulvivirga sont des cellules hétérotrophes, Gram-négatives, non flagellées, non sporulées, en forme de bâtonnet, et partagent la ménaquinone 7 (MK-7) comme quinone respiratoire majeure. Au moment de la rédaction, le genre comprend sept espèces, dont F. kasyanovii40, F. imtechensis41, F. lutimaris43, F. aurantia44, F. lutea42, F. marina45 et F. sediminis45. Jusqu'à présent, les membres de ce genre ne dégradent l'amidon que parmi les polysaccharides40,42,43,44.

Dans cette étude, nous avons isolé trois souches qui dégradent les polysaccharides et proposons trois nouvelles espèces du genre Fulvivirga avec les souches types SS9-22T, W9P-11T et SW1-E11T, sur la base d'une caractérisation comparative et complète des isolats avec les sept autres espèces du genre Fulvivirga. Les séquences complètes du génome entier des trois souches ont été déterminées et le répertoire des CAZymes et des PUL a été analysé. La capacité de dégradation des polysaccharides des isolats a été étudiée in silico et in vitro. La présence de CAZymes abondantes et la capacité à dégrader les polysaccharides indiquent que les trois nouvelles souches sont de riches sources d'enzymes glucidiques actives pour la dégradation des polysaccharides et une application biotechnologique potentielle.

La souche SS9-22T a été isolée d'une algue verte Ulva sp. collectés en mer de l'Est (Fig. 1A), et les souches W9P-11T et SW1-E11T ont été isolées d'une algue brune et de bois en décomposition, respectivement collectés en mer de l'Ouest (Fig. 1B, C), en République de Corée, respectivement . Des cultures pures des trois isolats ont été obtenues par sélection de la motilité de glissement sur un milieu VY/2 modifié (par litre, levure boulangère, 5,0 g ; CaCl2·2H2O, 1,0 g ; vitamine B12, 0,5 mg, gélose, 15 g) préparé pour contenir 60% d'eau de mer, tamponnée par HEPES (0, 6 g / L) pH 7, 2, et les trois souches purifiées ont bien poussé sur la gélose marine (MA) (Fig. 1D, E, F). Toutes les souches présentaient des colonies irrégulières sur le milieu solide. La couleur était jaune brunâtre pour SS9-22T, orange pour W9P-11T et jaune pâle pour la souche SW1-E11T (tableau 1). Les cellules des trois souches étaient en forme de tige avec une longueur de 2 à 5 µm et une largeur de 0, 25 à 3, 0 µm (Fig. 1G, H, I et Tableau 1).

Origine, morphologie des colonies et morphologie cellulaire de trois nouveaux isolats du genre Fulvivirga. (A, D, G) : souche SS9-22T ; (B, E, H) souche W9P-11T; (C, F, I) souche SW1-E11T. A : algues récoltées en mer de l'Est ; B : bois dégradé collecté en Mer Jaune ; C : algues récoltées en Mer Jaune ; D, E, F : morphologie des colonies de souches sur plaque MA ; G, H, I : images SEM de cellules de nouvelles souches. Barre d'échelle : 1 cm (A, B), 0,5 cm (C), 1 μm (G, H, I).

Pour déterminer la position taxonomique des isolats, les séquences du gène de l'ARNr 16S ont été déterminées. L'alignement des trois séquences d'ARNr 16S sur le site Web d'EzBioCloud (https://www.ezbiocloud.net/) a révélé que la souche SS9-22T était la plus proche de la souche Fulvivirga kasyanovii KCTC 12832T avec une similarité de 98,1 % ; les souches W9P-11T et SW1-E11T présentaient la similitude la plus proche avec F. sediminis 2943T de 94,9 % et 99,8 %, respectivement (tableau S1). Les séquences d'ARNr 16S de SS9-22T, W9P-11T et SW1-E11T ont été enregistrées respectivement sous les noms OM403091, OM403093 et OM403092 auprès de GenBank.

L'analyse phylogénétique basée sur les séquences du gène de l'ARNr 16S a montré que les trois isolats appartenaient à un clade monophylétique du genre Fulvivirga. Le regroupement était soutenu par des valeurs de bootstrap élevées de 93 % et 95 % dans les algorithmes de maximum de vraisemblance et de jonction de voisins, respectivement (Fig. 2). Fait intéressant, à l'intérieur du clade du genre Fulvivirga, la souche SS9-22T a créé un groupe séparé avec la souche F. marina 29W222T ; mais deux souches, SW1-E11T et W9P-11T, ont créé un groupe monophylétique avec la souche F. sediminis 2943T qui a été séparée de la souche SS9-22T. De plus, les valeurs de similarité du gène ARNr 16S parmi les trois isolats étaient inférieures à 98,1 % (tableau S1) et les valeurs de similarité entre les isolats et les sept espèces existantes étaient inférieures à 98,1 %, à l'exception de la valeur de similarité de 99,8 % entre la souche SW1. -E11T avec F. sediminis 2943T. Pour déterminer la position phylogénétique exacte des trois souches, une taxonomie polyphasique et une analyse du génome ont été réalisées.

Arbre phylogénétique à vraisemblance maximale construit par le logiciel MEGA7 (version 7.0.26) basé sur des séquences d'ARNr 16S montrant les positions de trois nouvelles souches SS9-22T, W9P-11T et SW1-E11T avec leurs plus proches représentants appartenant à l'ordre Cytophagales. La souche Flavobacterium aquatile NBRC 15052T (numéro d'accès GenBank AB517711) a été utilisée comme groupe externe. Les numéros d'accès GenBank sont indiqués entre parenthèses. Les séquences d'ARNr 16S ont été alignées par ClustalW et le résultat a été découpé dans le logiciel BioEdit (version 7.2.5). La méthode de rééchantillonnage bootstrap de 1000 répétitions a été appliquée pour évaluer l'arbre phylogénétique. Les valeurs bootstrap > 50 % sont présentées. Les cercles fermés représentent le consensus des nœuds récupérés en utilisant respectivement trois algorithmes, ML, NJ et MP. Les cercles ouverts représentent le consensus des nœuds récupérés trouvés à partir de deux algorithmes sur trois. Barre, 0,025 substitutions par position de nucléotide.

Les trois isolats étaient des bactéries mésophiles à coloration Gram négative, en forme de bâtonnet, qui sont communes aux espèces existantes du genre Fulvivirga. En revanche, deux souches, W9P-11T et SW1-E11T, se distinguent des autres espèces du genre Fulvivirga en contenant un pigment de type flexirubine. Les morphologies des colonies des trois nouvelles souches étaient irrégulières mais celles des autres espèces étaient circulaires. Les couleurs des colonies étaient également différentes de celles des autres espèces du genre Fulvivirga (tableau 1, fig. 1 et fig. S1). La souche SW1-E11T s'est développée lentement dans des conditions anaérobies ou microaérophiles, ce qui est similaire à F. sediminis 2943T 45 et F. marina 29W222T 45, tandis que les deux autres nouveaux isolats et les espèces restantes ont exclusivement poussé dans des conditions aérobies40,41,42,43 ,44. De plus, les trois isolats ont montré une motilité de glissement, qui différait de F. lutimaris KCTC 42720T 43 et F. imtechensis JCM 17390T 41. Fait intéressant, même si la souche SW1-E11T et F. sediminis 2943T partagent une grande similitude du gène ARNr 16S (99,8 % ), leurs caractéristiques phénotypiques présentaient plusieurs différences. Premièrement, la colonie de la souche SW1-E11T avait une surface lisse et brillante, tandis que la colonie de F. sediminis 2943T avait une surface rugueuse et sèche (Fig. S1). Deuxièmement, la souche SW1-E11T contenait un pigment de type flexirubine, mais pas F. sediminis 2943T (testé dans cette étude). Les caractéristiques détaillées des trois isolats et des espèces existantes du genre Fulvivirga sont présentées dans le tableau 1.

Les caractéristiques biochimiques des trois nouvelles souches SS9-22T, W9P-11T et SW1-E11T partagent des caractéristiques communes, telles que la dégradation de l'amidon, l'activité oxydase et catalase, et l'utilisation de D-cellobiose, dextrine, gentiobiose, D-glucose, D -mélibiose, D-raffinose, D-tréhalose et D-turanose avec les espèces existantes du genre Fulvivirga. Fait intéressant, seule la souche W9P-11T était positive pour l'utilisation de l'acide D-glucuronique, et seules les souches SS9-22T et W9P-11T utilisaient la L-sérine. De plus, seules les souches SW1-E11T et F. lutimaris KCTC 42720T ont montré une activité N-acétyl-β-glucosaminidase. Les trois nouvelles souches pourraient hydrolyser les Tweens 20 et 40, contrairement à F. aurantia KCTC 82638T et F. lutimaris KCTC 42720T. La dégradation de la caséine a été trouvée dans les souches SS9-22T et W9P-11T, mais pas dans la souche SW1-E11T. La dégradation de la chitine a été observée dans les souches SS9-22T, SW1-E11T, F. imtechensis JCM 17390T et F. kasyanovii KCTC 12832T, mais pas dans les souches W9P-11T, F. aurantia KCTC 82638T et F. lutimaris KCTC 42720T. Les souches SW1-E11T et F. sediminis 2943T présentaient plusieurs différences dans les caractéristiques biochimiques. La souche SW1-E11T était positive pour les activités DNase, β-galactosidase et β-glucosidase, et a montré une capacité à utiliser la N-acétyl-D-glucosamine, la glycyl-L-proline, le mélibiose, la pectine, le D-raffinose, le butyrate de sodium, D-tréhalose, D-turanose et stachyose tandis que F. sediminis 2943T n'est pas capable de les utiliser tous45. Des différences plus détaillées permettant de distinguer les trois nouvelles souches des autres espèces sont présentées dans le tableau 2.

Les principaux acides gras (> 5,0 %) des trois nouveaux isolats étaient iso-C15:0, iso-C17:0 3-OH, C16:1 ω5c, caractéristique sommée 3 (C16:1 ω7c/C16:1 ω6c), et iso-C15:0 3-OH. Notamment, la souche SS9-22T contenait 7,6 % d'iso-C15:1 G, ce qui est similaire à F. aurantia KCTC 82638T, F. marina 29W222T et F. lutimaris KCTC 42720T ; cette composante était plus faible dans les souches W9P-11T (2,4 %), SW1-E11T (2,8 %), F. sediminis 2943T (2,3 %) et F. imtechensis JCM 17390T (3,7 %), respectivement. De plus, la caractéristique sommée 3 était supérieure à 10 % dans les souches W9P-11T et SW1-E11T et F. sediminis 2943T que dans la souche SS9-22T et les souches de référence restantes (tableau 3). Avec la topologie de l'arbre phylogénétique (Fig. 2), le clade comprenant deux nouveaux isolats W9P-11T et SW1-E11T, et deux espèces reconnues F. sediminis 2943T et F. imtechensis JCM 17390T pourrait être distingué du reste de l'espèce par consistant en un pourcentage différent de composants d'acides gras de la caractéristique sommée 3 (C16: 1 ω7c / C16: 1 ω6c) et iso-C15: 1 G (tableau 3).

Les profils lipidiques polaires des trois isolats étaient similaires à ceux des espèces validement publiées du genre Fulvivirga. La souche SS9-22T contenait trois aminophospholipides, quatre lipides non identifiés, un aminolipide non identifié, un phospholipide non identifié et un glycolipide non identifié. La souche W9P-11T contenait de la phosphatidyléthanolamine (PE), trois lipides non identifiés, cinq aminolipides non identifiés, deux phospholipides non identifiés et trois aminophospholipides non identifiés. Pendant ce temps, la souche SW1-E11T contenait de la phosphatidyléthanolamine, trois aminophospholipides, quatre lipides non identifiés, un aminolipide non identifié et un phospholipide non identifié. Fait intéressant, F. sediminis 2943T ne contient aucun phospholipide dans le profil lipidique polaire45, qui diffère de la nouvelle souche SW1-E11T (Fig. S2).

Les génomes complets des souches SS9-22T, W9P-11T et SW1-E11T ont été déterminés par une combinaison de plateformes de séquençage Nanopore et Illumina. Chacune des trois souches contenait un seul chromosome circulaire ayant une taille de 6,98, 6,52 et 6,39 Mb, respectivement. La teneur en G + C des nouvelles souches était de 38,1 % à 41,9 %, similaire à la gamme des espèces existantes de 37,3 % à 42,7 % (tableau 4). L'analyse CheckM a montré que les trois génomes assemblés étaient très complets et peu contaminés (tableau 4), ce qui indique la haute qualité et la fiabilité des génomes assemblés par la combinaison de deux méthodes de séquençage. Une comparaison des propriétés génomiques des trois isolats avec des membres connus du genre Fulvivirga est présentée dans le tableau 4. Étant donné que tous les génomes assemblés du genre Fulvivirga sont très complets (> 98 %), nous avons pu effectuer des analyses génomiques détaillées et des comparaisons.

Pour vérifier si les génomes des isolats sont taxonomiquement différents, des valeurs moyennes d'identité nucléotidique (ANI) et d'hybridation numérique ADN-ADN (dDDH) ont été calculées. Les valeurs d'ANI et de dDDH parmi les trois isolats et les espèces existantes du genre Fulvivirga (tableau 5) se situaient respectivement dans des plages de 69,1 % à 85,4 % et de 17,1 % à 29,7 %, qui étaient significativement inférieures aux valeurs seuils. de 95 à 96 % pour la valeur ANI46 et de 70 % pour la valeur dDDH47 pour distinguer les espèces bactériennes. Fait intéressant, bien que la similarité du gène ARNr 16S des souches SW1-E11T et F. sediminis 2943T était de 99,8 %, les valeurs ANI et dDDH étaient respectivement de 84,34 % et 27,4 %, qui étaient inférieures aux valeurs seuils pour distinguer deux espèces. L'arbre phylogénétique basé sur le génome (Fig. 3) présentait systématiquement non seulement la position phylogénétique des trois nouvelles souches SS9-22T, W9P-11T et SW1-E11T à l'intérieur du groupe du genre Fulvivirga, comme dans l'ARNr 16S arbre phylogénétique (Fig. 2), mais aussi séparation des isolats des espèces existantes, comme l'ont montré les valeurs inférieures d'ANI et de dDDH. Par conséquent, la différenciation basée sur une analyse du génome entier a révélé que les trois isolats représentent trois nouvelles espèces du genre Fulvivirga.

Arbre phylogénétique à vraisemblance maximale montrant la relation entre les espèces étroitement apparentées SS9-22T, W9P-11T et SW1-E11T sur la base de 92 gènes principaux identifiés à l'aide du pipeline UBCG. Les numéros d'accès GenBank des séquences du génome entier sont indiqués entre parenthèses. Flavobacterium aquatile ATCC 11947T (GCF_002217235) comme groupe externe. Les valeurs bootstrap basées sur 1000 répétitions sont indiquées au niveau des nœuds de branche. Barre, 0,1 substitutions par site.

L'analyse du génome a révélé que trois souches contiennent un certain nombre de gènes pour produire des composés bioactifs et un grand nombre d'enzymes glucidiques actives. L'analyse antiSMASH48 a prédit plusieurs gènes codant pour les polykétides et la peptide synthétase non ribosomale dans le génome des souches SS9-22T, W9P-11T et SW1-E11T. Presque tous les membres du genre Fulvivirga devraient produire un nombre élevé de métabolites secondaires bioactifs (15 à 26 groupes de gènes biosynthétiques (BGC)), à l'exception de F. aurantia KCTC 82638T, F. marina 29W222T et F. lutea S481T ( 2 à 4 BGC) (tableau S2). Dans les trois isolats, un nombre élevé de gènes ont été distribués dans le groupe de groupes orthologues (COG) pour le transport et le métabolisme des acides aminés, suivis de la traduction, de la structure ribosomique et de la biogenèse, et de la biogenèse de la paroi cellulaire/membrane/enveloppe (Fig. S3) . Les gènes impliqués dans l'utilisation des glucides ont été identifiés sur la base de la base de données CAZy (http://www.cazy.org/)49, qui fournit des informations sur les glycosides hydrolases (GHs, hydrolyze glycosidic bonds), les glycosyltransférases (GTs, form glycosidic bonds), les polysaccharides les lyases (PL, clivent les liaisons glycosidiques par un mécanisme d'éliminase), les estérases glucidiques (CE, hydrolysent les liaisons ester) et les activités auxiliaires (AA, enzymes redox agissant avec d'autres CAZymes). Le génome de la souche SS9-22T contenait 325 modules CAZy au total, dans lesquels 112 gènes codaient pour des protéines dégradées par les glucides. Le génome de la souche W9P-11T contenait un total de 354 modules CAZy, dans lesquels 187 gènes annotés étaient liés à la dégradation des glucides, c'est-à-dire GH, PL et CE. Pendant ce temps, le génome de la souche SW1-E11T encodait un total de 260 modules CAZy, dans lesquels 138 gènes encodaient des protéines liées aux GH, PL et CE (tableau 6). Le génome complet de F. lutea S481T a été déterminé, et nous avons donc comparé le génome de F. lutea S481T avec ceux des trois isolats pour accéder aux capacités de dégradation des glucides en utilisant la base de données CAZy. En effet, le nombre de modules CAZy de F. lutea S481T est le tiers de celui des trois isolats. Grâce au serveur dbCAN50, nous avons pu compter le nombre de modules CAZy à partir des génomes incomplets des autres membres du genre Fulvivirga (tableau S3). Le nombre de GH des trois nouveaux isolats était légèrement inférieur au nombre de gènes annotés dans la base de données CAZy. Le génome des trois nouvelles souches a codé un nombre significativement plus élevé de GH que ceux de F. aurantia KCTC 82638T, F. imtechensis JCM 17390T, F. kasyanovii KCTC 12832T, F. lutea S481T et F. lutimaris KCTC 42720T (tableau S3) . Les génomes des souches W9P-11T et SW1-E11T avaient une fréquence plus élevée de GH (24,5 et 17,4 GH par Mb, respectivement) en comparaison avec les autres espèces du genre Fulvivirga (tableau S3), à l'exception de F. sediminis 2943T (21,79 GH par Mb), et également supérieure à la fréquence médiane des GH (12 GH par Mb) chez les Bacteroidota marins51. Fait intéressant, la présence de CAZymes codées dans les génomes des trois nouvelles souches était de 1,4 à 3,5 fois plus élevée que dans les génomes des autres membres appartenant à la classe Flavobacteriia (Formosa agariphila KMM 3901T, 19337 ; Gramella flava JLT2011, 18451 ; et Polaribacter spp., 100–14638,52), qui sont connus comme dégradeurs de polysaccharides.

Les gènes de la dégradation des polysaccharides ont été identifiés via les serveurs de dbCAN50 et PULDB53 sur CAZy49. Grâce au serveur dbCAN, les groupes de gènes CAZyme (CGC)54, qui ont un arrangement de gènes similaire à celui de PUL, ont été trouvés chez tous les membres du genre Fulvivirga (tableau S3). Les génomes des souches SS9-22T, W9P-11T et SW1-E11T contenaient 58 à 70 CGC, soit deux fois plus que ceux de F. aurantia KCTC 82638T, F. lutea S481T, F. lutimaris KCTC 42720T ; le nombre de CGC codés dans le génome de la souche SS9-22T (58 CGC) était similaire aux nombres de F. imtechensis JCM 17390T et F. kasyanovii KCTC 12832T (tableau S3). Grâce à PULDB, les loci d'utilisation des polysaccharides (PUL) ont été trouvés à partir des séquences complètes des souches SS9-22T, W9P-11T, SW1-E11T et F. lutea S481T ; les nombres PUL étaient respectivement de 24, 41, 32 et 4 (tableau S3). La distribution des CAZymes dans les PUL était différente entre les nouveaux isolats et la souche F. lutea S481T. En effet, la souche F. lutea S481T n'a que quatre protéines putatives liées à la dégradation des glucides dans les PUL, alors que ces nombres étaient de 54, 143 et 47 dans les PUL des souches SS9-22T, W9P-11T et SW1-E11T génomes, respectivement. Cela a montré que les nouveaux isolats peuvent avoir un potentiel plus élevé de dégradation des polysaccharides que les membres connus du genre Fulvivirga. Fait intéressant, les PUL de la souche W9P-11T contenaient un nombre élevé de modules de liaison aux glucides (CBM) répartis dans treize PUL. Les CBM favorisent l'activité catalytique de la CAZyme en aidant l'enzyme à se lier au substrat cible, en particulier les polysaccharides insolubles, diminuant ainsi la distance entre l'enzyme et le substrat55. La présence d'un nombre élevé de CBM indique que la souche W9P-11T pourrait effectivement dégrader le polysaccharide insoluble dans le milieu marin. De plus, la présence de plusieurs sulfatases (deux gènes de SS9-22T ; un gène de la souche W9P-11T) dans les PUL des trois nouvelles souches indique que ces PUL pourraient dégrader les polysaccharides sulfatés. Grâce au PULDB, les substrats PUL putatifs ont pu être prédits. Dans le génome de la souche W9P-11T, PUL 10 abritait le double gène tandem susC/susD consécutif à la présence entrelacée de cinq GH43 et deux GH51, qui devaient hydrolyser l'arabinane56. De plus, dans le génome de la souche SS9-22T, PUL 21 code pour les gènes susC/susD en tandem proches de deux GH16 et GH3. Ceci était similaire aux PUL 139 et 142 de Gillisia spp. Hel1_29, Hel1_33_143 et PUL 173 de Gramella sp. MAR_2010_147 devrait utiliser la laminarine52. Curieusement, la souche SS9-22T a produit des enzymes actives dégradant la laminarine dans un bouillon de culture (tableau 7). Pendant ce temps, PUL 18 et PUL 23 de la souche W9P-11T contenaient des quantités abondantes de GH43, GH2 et GH92, qui devaient hydrolyser les substrats riches en mannose, similaires au PUL 340 de Salegentibacter sp. Hel1_652. De plus, l'abondance de CBM6, CBM13, CBM32 et CBM88 dans ces PUL indiquait une amélioration de l'activité catalytique en assurant un contact plus étroit des enzymes GH avec les substrats55. Semblable à la souche W9P-11T, dans le génome de la souche SW1-E11T, PUL 2 contenait également des gènes susC/susD en tandem proches de deux GH51 et trois GH43, qui devaient dégrader l'arabinane56. PUL 18 des souches SS9-22T, PUL 20 et PUL 38 de la souche W9P-11T, PUL 23 de la souche SW1-E11T et PUL 2 de la souche F. lutea S481T contenaient GH13, et GH13 devrait être impliqué dans l'hydrolyse de amidon29. La présence des PUL d'utilisation de l'amidon était cohérente avec l'observation selon laquelle les trois nouvelles souches et les souches types existantes présentaient toutes une activité de dégradation de l'amidon in vitro.

Les activités enzymatiques extracellulaires pour la dégradation de l'alginate, du κ-carraghénane, de la cellulose, de la chitine, du fucoïdane, de la laminarine, de l'amidon et du xylane ont été testées en détectant un sucre réduit par le dosage de l'acide 3, 5-dinitrosalicylique. Les trois souches SS9-22T, W9P-11T et SW1-E11T pourraient dégrader l'amidon et le xylane (tableau 7). La dégradation de l'amidon a été étayée par la découverte que les trois souches contiennent un nombre élevé de GH13, qui est principalement responsable de l'α-amylase57,58 et du GH57 (tableau S4). De plus, les souches SS9-22T, W9P-11T et SW1-E11T contenaient également de nombreux gènes de xylanase appartenant aux familles GH359, GH560, GH1060 et GH3060,61 (tableau S4). Fait intéressant, la souche SS9-22T pouvait dégrader la laminarine et le génome de la souche contenait le PUL 21, qui est très similaire au PUL spécifique à la laminarine de Gramella forsetii KT0803T en termes d'organisation des gènes62. Cela a indiqué que l'étude de la construction du gène dans les PUL pouvait prédire le substrat candidat. Seule la souche SS9-22T parmi les trois isolats pouvait dégrader l'alginate, et seule la souche W9P-11T parmi les trois isolats pouvait dégrader la chitine. Le génome de la souche SS9-22T avait un PL6 et trois PL7, qui sont responsables de la dégradation de l'alginate26. Le génome de la souche W9P-11T contenait onze GH3, dix GH5, quatre GH18, deux GH20, trois GH23 et un GH48, qui sont tous connus pour participer à la dégradation de la chitine63,64. La détection des activités de dégradation des polysaccharides et la présence de gènes correspondants indiquent que les trois nouvelles souches pourraient produire des enzymes dégradant les polysaccharides.

À partir de la combinaison d'analyses basées sur le génome et basées sur l'expérience pour la dégradation des polysaccharides, les membres du genre Fulvivirga ont montré les traits d'adaptation et de spécialisation dans la dégradation des polysaccharides par la contribution de CAZyme37,65. En effet, les souches isolées d'algues, de bois en décomposition et de sédiments, notamment F. ulvae SS9-22T, F. maritima SW1-E11T, F. ligni W9P-11T, F. sediminis 2943T, F. marina 29W222T et F. lutimaris KCTC 42720T contenait un nombre élevé de modules CAZy, ce qui correspondait à plus de 2, 60% du total des gènes (tableau S3). La souche F. aurantia KCTC 82638T isolée de l'eau de mer contenait quant à elle un faible nombre de modules CAZy de 55 gènes, soit seulement 1,37 % des gènes du total des gènes. De plus, un test in vitro dans cette étude a montré que les souches SS9-22T et SW1-E11T étaient capables de dégrader l'alginate, la chitine, la laminarine, l'amidon et le xylane, qui sont des polysaccharides associés aux algues, par les CAZymes correspondants (tableau 7). Pris ensemble, les résultats montrent que les membres du genre Fulvivirga ont une capacité élevée à dégrader les polysaccharides marins, et en particulier les trois nouveaux isolats ont montré un potentiel fortement plus élevé à cet égard que les espèces connues.

Grâce à une approche polyphasique, cette étude a présenté les trois nouvelles espèces du genre Fulvivirga du phylum Bacteroidota en tant que riches sources d'enzymes glucidiques actives et également en tant que dégradeurs potentiels de polysaccharides. Par la méthode d'isolement consistant à imiter les conditions naturelles, les souches types des trois nouvelles espèces ont été purement isolées. L'analyse des génomes et un test de dégradation des polysaccharides des trois nouvelles espèces ont permis de découvrir la bioproduction potentielle des trois nouvelles espèces, fournissant des informations et une stratégie pour une étude plus approfondie des enzymes actives hydrolysant les polysaccharides marins.

Fulvivirga ulvae (ul'vae. L. gen. n. ulvae d'Ulva, nom de l'espèce d'algue dont il est isolé).

Les cellules sont gram-négatives, mésophiles, neutrophiles et en forme de bâtonnet. Ils sont strictement aérobies et positifs à la catalase et à l'oxydase. Les colonies sur gélose MB sont irrégulières et brillantes, formant une touffe dans la zone centrale et de couleur jaune à brunâtre. La croissance se produit à 10–45 °C (optimum, 37 °C), à pH 6,0–8,0 (optimum, pH 7,0) et avec 0,5–15 % de NaCl (optimum, 2 %). H2S est produit. Positif pour l'hydrolyse de la caséine, de la gélatine, des Tweens 20, 40 et de la dégradation de l'alginate, de la laminarine, de l'amidon et du xylane. Négatif pour les pigments de type flexirubine. Négatif pour l'hydrolyse du Tween 80. Les principaux composants d'acides gras sont iso-C15:0, iso-C17:0 3-OH et C16:1 ω5c.

La souche type, SS9-22T (= KCTC 82072T = GDMCC 1.2804T), a été isolée de l'algue verte Ulva sp. Le génome contient un chromosome circulaire de 6,98 Mo de long. La teneur en G + C est de 41,85 %, calculée à partir du séquençage du génome entier.

Fulvivirga ligni (lig'ni. L. gen. n. ligni, de bois, se référant à la source d'isolement).

Les cellules sont gram-négatives, mésophiles, neutrophiles et en forme de bâtonnet. Ils sont strictement aérobies et positifs à la catalase et à l'oxydase. Les colonies sur gélose MB sont irrégulières, brillantes et orange. La croissance se produit à 10–37 °C (optimum, 30 °C), à pH 5,5–8,0 (optimum, pH 6,0–7,0) et avec 0,5–12 % de NaCl (optimum, 1–2 %). H2S est produit. Positif pour l'hydrolyse de la caséine, de la chitine, de la gélatine, des Tweens 20 et 40 et la dégradation de l'amidon et du xylane. Positif pour la production de pigments de type flexirubine. Négatif pour l'hydrolyse du Tween 80. Les principaux composants d'acides gras sont iso-C15:0, iso-C17:0 3-OH, C16:1 ω7c/C16:1 ω6c et C16:1 ω5c.

La souche type, W9P-11T (= KCTC 72992T = GDMCC 1.2803T), a été isolée d'un bois dégradé. Le génome contient un chromosome circulaire de 6,52 Mb de long. La teneur en G + C est de 38,95 %, calculée à partir du séquençage du génome entier.

Fulvivirga maritima (ma.ri'ti.ma. L. fem. adj. maritima du milieu marin, maritime, faisant référence à l'habitat d'isolement).

Les cellules sont gram-négatives, mésophiles, neutrophiles et en forme de bâtonnet. Ils sont positifs pour les activités micro-aérophiles, catalase et oxydase. Les colonies sur gélose MB sont irrégulières, jaune pâle, lisses et jaune foncé au centre des colonies. La croissance se produit à 10–37 °C (optimum, 30 °C), à pH 6,0–8,0 (optimum, pH 7,0) et avec 0,5–12 % de NaCl (optimum, 2 %). H2S est produit. Positif pour l'hydrolyse de la gélatine et des Tweens 20, 40 et 80, et la dégradation de la laminarine, de l'amidon et du xylane. Négatif pour l'hydrolyse de la caséine. Positif pour la production de pigments de type flexirubine. Les principaux composants des compositions d'acides gras sont iso-C15:0, iso-C17:0 3-OH, caractéristique sommée 3 (C16:1 ω7c/C16:1 ω6c) et C16:1 ω5c.

La souche type SW1-E11T (= KCTC 72832T = GDMCC 1.2802T) a été isolée d'une algue vert foncé. Le génome contient un chromosome circulaire de 6,39 Mb de long. La teneur en G + C est de 38,14 %, calculée à partir du séquençage du génome entier.

Des algues et du bois dégradé ont été ramassés dans l'océan Pacifique Nord dans la zone appartenant à la République de Corée. Les algues brunes et le bois dégradé ont été collectés le 14 octobre 2019 à Dongho-ri, Hae-myeon, Gochang-gun, province de Jeollabuk (Mer de l'Ouest) (35°31′01.6″ N, 126°28′57.4″ E) . L'algue verte Ulva sp. a été collecté le 15 janvier 2020, au port de Sodol, Jumunjin, province de Gangwon (mer de l'Est) (37°54′16.9″ N, 128°49′48.2″ E). Pour la méthode d'isolement, la stratégie d'imitation des conditions naturelles de la bactérie a été appliquée. En effet, le milieu d'isolement a été préparé à base d'eau de mer à soixante pour cent (prélevée sur le site de prélèvement), alimentée en gélose à 1,5 % (p/v) (BD) et injectée avec 50 mg/L de cycloheximide de stérilisation filtré (Aldrich Sigma) après autoclavage du milieu. De plus, un morceau de papier filtre (1 cm2, Whatman n° 2) a été placé sur la surface de la plaque de gélose d'isolement comme support pour l'échantillon. Un morceau de chaque échantillon a ensuite été placé sur la surface du papier filtre et inoculé à 28 ℃ en condition aérobie. Par la suite, le signal des bactéries glissantes apparues à la surface de la gélose a été observé au stéréomicroscope (ZEISS Stemi 508), et les cellules bactériennes glissantes ont été captées par une aiguille pointue (diamètre intérieur de 0,26 mm) et transférées dans un milieu nutritif de milieu VY/2 tamponné à l'eau de mer à 60 % (dans 1 L : 600 mL d'eau de mer, 5 g de levure de boulanger (Aldrich Sigma), 15 g de gélose, 400 mL d'eau distillée, pH 7,0 ± 0,2, ajusté par du NaOH 1 M, 25 mg vitamine B12 filtrée-stérilisée). Le milieu VY/2 tamponné à l'eau de mer à 60 % favorise la motilité de glissement des bactéries cibles66. Dans le milieu nutritif, après trois à cinq jours d'incubation, le bord des cellules glissantes a été ramassé et les cellules ont été transférées dans le milieu frais de la plaque de gélose VY/2 tamponnée à l'eau de mer à 60 %, jusqu'à l'obtention de la culture pure. Toutes les cultures pures ont été conservées dans du glycérol à 20% à -80°C et une ampoule lyophilisée à 4°C. Des cultures pures des trois nouvelles souches ont été déposées à la Korean Collection for Type Cultures (KCTC) et au Guangdong Microbial Culture Collection Center (GDMCC).

Pour identifier les trois nouveaux isolats, leurs gènes d'ARNr 16S ont été amplifiés sur la base de quatre amorces universelles, 27F67, 518F68, 805R69 et 1492R67, et séquencés par la méthode Sanger. Les séquences complètes ont été assemblées manuellement à l'aide du logiciel vectoriel NTI70. L'alignement de séquences par paires des séquences a été effectué sur EzBioCloud (https://www.ezbiocloud.net/). Le logiciel BioEdit (version 7.2.5)71 a été utilisé pour les alignements multiples ClustalW et le découpage des résultats. Le fichier découpé a été utilisé pour construire des arbres phylogénétiques basés sur trois algorithmes du logiciel MEGA772 consistant en la jonction de voisins (NJ)73, la vraisemblance maximale (ML)74 et la parcimonie maximale (MP)75. Le modèle optimal pour l'arbre MP était le modèle à 2 paramètres de Kimura, et les taux et les modèles étaient distribués gamma avec des sites invariants (G + I), tandis que le modèle de Kimura à deux paramètres76 a été utilisé pour NJ et arbre-bisection-reconnexion (TBR) a été utilisé pour l'algorithme ML. L'alignement par paires entre les trois nouvelles souches a été calculé sur le logiciel BioEdit (version 7.2.5)71 après rognage.

Les caractéristiques physiologiques des trois souches ont été déterminées. Toutes les expériences ont été dupliquées. La morphologie des colonies a été observée sur des plaques de gélose marine (MA) après trois jours de culture dans des conditions aérobies. La coloration de Gram a été réalisée selon le protocole standard77 et les résultats ont été observés au microscope optique (Nikon Eclipse 80i). La morphologie cellulaire a été observée au microscope électronique à balayage (SEM, JEOL JSM 7600F)78. La température de croissance a été déterminée dans un bouillon marin (MB), pendant 7 jours à 4, 10, 15, 20, 25, 30, 37, 45 et 60 °C, comme décrit par Goldberg et al.44. La plage de pH pour la croissance a été ajustée dans MB à pH 4,0–8,0 en utilisant un tampon phosphate/HCl Na2HPO4 0,1 M/NaH2PO4 0,1 M44 et pH 9,0–10,0 en utilisant un tampon Na2CO3 0,1 M/NaHCO3 0,1 M79, tous deux à des intervalles d'unité de pH de 0,5 . Les cellules des trois nouvelles souches ont été cultivées dans le MB tamponné stérilisé par la membrane Millex® VV 0,1 µm et incubées à 30 °C selon Goldberg et al.44. En se référant à Jung et al.43, la tolérance saline a été déterminée sur le MB de complément, qui a été contrôlé avec diverses concentrations de NaCl (0, 0,5 et 1,0–16,0 % (p/v) par incréments de 1,0 %) à 30 °C , pH 7,044. Pour évaluer les besoins en oxygène, les trois nouvelles souches ont été cultivées sur des plaques MA et incubées dans des conditions aérobies, microaérophiles (dans un bocal fermé avec un emballage de système de conteneur BD GasPak EZ CO2) et anaérobies (dans un bocal fermé avec un emballage de BD GasPak EZ anaerobe container system) pendant une semaine à 28 °C. Pour évaluer les pigments de type flexirubine, des gouttes de solution de KOH à 20% ont été ajoutées à la surface des colonies et les résultats positifs et négatifs ont été contrôlés en fonction du changement de couleur des colonies, comme décrit dans 80. L'activité de glisse a été testée par la méthode de la goutte suspendue, comme décrit par Bowman81.

Les cellules des trois nouveaux isolats et leurs souches de référence cultivées sur MA à 30 °C pendant deux jours ont été utilisées pour identifier les caractéristiques biochimiques. Les cellules ont été inoculées en parallèle sur des microplaques API ZYM, API 20NE (bioMérieux) et GEN III (Biolog) selon les instructions des fabricants, sauf que la solution saline a été incluse dans les fluides d'inoculation pour une concentration finale de 2 % (w/ v)44. L'hydrolyse de l'amidon a été testée sur MA avec de l'amidon à 0,2 % (p/v) et détectée par une zone claire après coloration avec une solution d'iode82. L'hydrolyse de la cellulose a été évaluée sur une plaque de gélose CMC (dans 1 L : 1 g de NH4H2PO4, 0,2 g de KCl, 1 g de MgSO4.7H2O, 1 g d'extrait de levure, 26 g de sel de sodium de carboxyméthylcellulose, 20 g de NaCl, 15 g de gélose, dans 1 L d'eau de mer artificielle83), et détectée par une zone claire après enrobage dans du Rouge Congo et lavage avec une solution de NaCl à 1 %. L'activité de dégradation de la chitine a été examinée sur un milieu salin minimal (dans 1 L : 0,5 g de KH2PO4, 1,5 g de K2HPO4, 1 g de NH4NO3, 20 g de NaCl, 1 mg d'extrait de levure, 0,5 g de chitine, pH 7,0, 20 g de gélose, eau distillée 1000 mL) selon Xu et al.84 pendant sept jours à 30 ℃. L'hydrolyse des Tweens 20, 40 et 80 (1 %, v/v) a été déterminée en utilisant MA comme milieu de base79,85. La production de H2S a été testée sur MB, alimentée en thiosulfate de sodium 5 g/L, et détectée à l'aide d'une bande de papier filtre imprégnée d'acétate de plomb79,85. Afin de déterminer l'activité catalase, une solution de H2O2 à 3 % a été déposée à la surface des cellules82. L'activité oxydase a été testée par la réaction des cellules au réactif oxydase (bioMérieux). L'activité DNase a été examinée sur gélose DNase (Difco) en utilisant de l'eau de mer artificielle83 avec 2 % de NaCl au lieu d'eau distillée. L'activité de la gélatinase a été testée sur de la gélatine nutritive (milieu Remel Gelatin), dans lequel l'eau distillée a été remplacée par de l'eau de mer artificielle83 avec 2% de NaCl, pendant une semaine à 25 ℃, et un résultat positif a été reconnu par la présence de milieu liquide82.

Les caractéristiques chimiotaxonomiques de SS9-22T, W9P-11T et SW1-E11T ont été déterminées. Pour le profil des acides gras des trois nouveaux isolats et de leurs souches de référence, des cellules cultivées sur MA pendant deux jours ont été récoltées. Le protocole standard MIDI86 (version 6.2) a été appliqué pour extraire les composants acides gras. Les esters méthyliques d'acides gras extraits ont ensuite été injectés dans un chromatographe en phase gazeuse86, et les composants ont été identifiés sur la base de la base de données TSBA 6.087. Les types de quinone SS9-22T, W9P-11T et SW1-E11T ont été extraits de 100 mg de cellules lyophilisées de chaque souche par agitation dans du chloroforme-méthanol (2: 1, v / v) pendant une nuit. Les extraits ont été concentrés et redissous dans de l'acétone à 100 %. La suspension d'acétone a été appliquée à une chromatographie sur couche mince (TLC, Kieselgel 60F254, 20 × 20 cm, Merck) et séparée dans un solvant combiné d'éther de pétrole et d'éther diéthylique (9:1, v/v). La bande détectée sous lumière UV a été marquée, récoltée et récupérée dans l'acétone. Les extraits ont ensuite été purifiés par chromatographie liquide haute performance en phase inversée (système LC20AD, Shimadzu) à l'aide d'une colonne ODS-2 (C18) (150 × 4,6 mm ID; colonne HPLC YMC), avec une combinaison de méthanol-éther isopropylique ( 3:1, v/v) comme phase mobile et longueur d'onde de 270 nm pour détecter les composants quinones87. Les lipides polaires des trois nouvelles souches ont été extraits de leurs cellules lyophilisées selon la méthode détaillée décrite par Komagata et Suzuki88. Les lipides extraits ont été appliqués sur un quart d'une plaque de gel de silice TLC, et la première dimension a été développée dans des solvants combinés de chloroforme-méthanol-eau (65:25:4, v/v/v), puis la deuxième dimension a été développée dans un système solvant chloroforme-méthanol-acide acétique-eau (80:15:12:4, v/v/v/v)87. Les plaques TLC ont été pulvérisées avec divers réactifs appropriés pour identifier les profils lipidiques polaires des nouveaux isolats, y compris l'acide molybdatophosphorique pour identifier les lipides totaux, la ninhydrine pour les groupes amino, le bleu de molybdène pour les groupes phosphate et l'α-naphtol dans une solution d'acide sulfurique pour détecter les groupes de sucre89.

L'ADN génomique des souches SS9-22T, W9P-11T et SW1-E11T a été extrait d'une culture de deux jours sur une plaque MA en utilisant un kit NucleoSpin Microbial DNA (MACHEREY – NAGEL, Allemagne), conformément aux instructions du fabricant. La qualité de l'ADN génomique a été quantifiée par Nanodrop 2000/2000c et la longueur de la taille a été contrôlée sur un gel d'électrophorèse à 1 % d'agarose.

Les séquences du génome entier des trois nouveaux isolats ont été déterminées par la combinaison de deux méthodes de plate-forme, la plate-forme Illumina (à Macrogen, Inc., Séoul, République de Corée) et la plate-forme Nanopore (au Biological Resource Center, Korea Research Institute of Bioscience et biotechnologie, République de Corée). Pour le séquençage Illumina, l'ADN de courte longueur a été utilisé pour créer une bibliothèque basée sur le protocole du guide de préparation d'échantillons TruSeq DNA PCR-Free, partie #15036187 Rev. D. Pour le séquençage des nanopores, l'ADN de poids moléculaire élevé a été utilisé. pour préparer la librairie selon le protocole Native barcoding genomic DNA (avec EXP-NBD104, et SGK-LSK109, version NBE_9065_v109_revV_14Aug2019). Les génomes ont été assemblés de novo par Canu (version 2)90. Medaka (version 1.3.2, https://github.com/nanoporetech/medaka) a été utilisé comme outil de polissage pour l'assemblage en comptant les occurrences de chaque nucléotide à chaque position sur la séquence assemblée pour prédire la vraie base à cette position. La qualité des génomes assemblés et l'exhaustivité des annotations ont été quantifiées sur BUSCO (https://busco.ezlab.org/)91. La contamination et la complétude des génomes ont été estimées par CheckM (version 1.1.3)92. Les génomes ont été annotés sur Prokka (version 1.12)93. L'hybridation numérique ADN-ADN a été calculée à l'aide de l'outil d'identité nucléotidique moyenne (ANI) sur EzBioCloud (https://www.ezbiocloud.net/tools/ani)46 et du calculateur de distance génome à génome (version 2.1) sur DSMZ ( https://ggdc.dsmz.de/ggdc.php#)47. A partir de la séquence complète du génome, la teneur en G + C a été calculée. Les séquences de gènes obtenues à partir du pipeline Prokka ont été annotées avec la base de données COG94 en utilisant RPS-BLAST95 (e-value = \({10}^{-4}\)) intégré dans WebMGA (https://github.com/weizhongli/ webMGA)96. Les enzymes glucidiques actives ont été annotées à l'aide du métaserveur dbCAN250 et de la base de données CAZy97. Les grappes de gènes biosynthétiques (BGC) ont été prédites par antiSMASH 6.048.

L'arbre phylogénétique basé sur le génome entier a été construit sur le pipeline actualisé du gène central bactérien (UBCG) contenant 92 gènes principaux98. Flavobacterium aquatile ATCC 11947T (GCF_002217235) comme groupe externe.

Pour tester l'activité des enzymes dégradant les polysaccharides, le milieu liquide a été préparé en ajoutant les substrats polysaccharidiques suivants au bouillon marin : κ-carraghénane, cellulose, chitine, alginate de sodium, amidon et xylane 0,2 % (p/v) ; fucoïdane et laminarine 0,1 % (p/v)99. Les cellules récoltées le deuxième jour sur des plaques MA ont été inoculées. La concentration cellulaire initiale a été fixée de la même manière à OD600nm 0,2. Le témoin négatif était le milieu de culture sans cellules bactériennes. Après trois jours, le surnageant de la culture a été récolté et mis à réagir avec de l'acide 3,5-dinitrosalicylique (DNS)100 pour détecter la production de sucres réducteurs. En bref, le surnageant a été mis à réagir avec le réactif DNS (1: 3, v / v) dans un tube à essai en verre, puis le tube a été chauffé dans un bain d'eau bouillie pendant 5 min. Les tubes ont été refroidis sous l'eau du robinet. L'absorbance à 570 nm a été mesurée pour détecter tout sucre réducteur libéré par la dégradation des polysaccharides100.

Les ensembles de données générés et analysés au cours de l'étude actuelle sont disponibles dans le référentiel NCBI. Le numéro d'accès GenBank des séquences du gène de l'ARNr 16S des souches SS9-22T, W9P-11T et SW1-E11T est OM403091, OM403093 et OM403092, respectivement. Les numéros de séquence GenBank sont respectivement CP089981, CP089979 et CP089980.

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Les auteurs remercient le Prof. Dr. Bernhard Schink de l'Université de Constance (Allemagne) pour son aide sur les nomenclatures de trois nouvelles espèces. Le programme d'initiative de recherche de l'Institut coréen de recherche sur les biosciences et la biotechnologie (KRIBB) (KGM5232322) et la subvention de la Fondation nationale de recherche de Corée (NRF) financée par le gouvernement coréen (MSIT) (n° NRF-2021M3H9A1030164) ont soutenu cette recherche.

Biological Resource Center, Korean Collection for Type Cultures, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, Jeongeup, 56212, République de Corée

Tra TH Nguyen, Zhun Li, Yong-Jae Lee, Jaeho Ko et Song-Gun Kim

Département de biotechnologie, KRIBB School, University of Science and Technology (UST), Daejeon, 34113, République de Corée

Tra TH Nguyen, Zhun Li et Song-Gun Kim

Université des sciences de Hanoï, Université nationale du Vietnam, Hanoï, 10000, Vietnam

Tien Q. Vuong

L'Université de Danang, Université des sciences et technologies, 54 Nguyen Luong Bang St., Da Nang, 550000, Vietnam

Ho Le Han

GB Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry of the Far-Eastern Branch of the Russian Academy of Sciences, Vladivostok, Russie, 690022

Olga I. Nedashkovskaïa

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TTHN a réalisé les expériences, y compris la collecte d'échantillons, l'isolement et la caractérisation des bactéries, a analysé les génomes pour la dégradation des polysaccharides et a rédigé le manuscrit. TQV a analysé les génomes, construit un arbre génomique UBGC et écrit une méthode d'analyse du génome. HLH a déterminé les caractéristiques phénotypiques et biochimiques des bactéries et a écrit des méthodes pour ces parties. ZL a pris des images SEM. YL et JK ont assemblé les génomes des souches. OIN a finalisé le manuscrit. SG.K. supervisé toutes les expériences et finalisé le manuscrit. Tous les auteurs ont examiné le manuscrit.

Correspondance avec Song-Gun Kim.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Nguyen, TTH, Vuong, TQ, Han, HL et al. Trois espèces marines du genre Fulvivirga, riches sources d'enzymes glucidiques actives dégradant l'alginate, la chitine, la laminarine, l'amidon et le xylane. Sci Rep 13, 6301 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-33408-4

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Reçu : 11 octobre 2022

Accepté : 12 avril 2023

Publié: 18 avril 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-33408-4

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